Uji Klinis Collagen Peptides

Aktivitas biologis peptida kolagen diperoleh dengan hidrolisis enzimatik

--------------------
Popov A.1, 2, *, Artyukov A.1, Krivoshapko O.1, Kozlovskaya E.1

1G. B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry Far Eastern Branch, Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia, Vladivostok, Rusia 2Far Eastern State University, Vladivostok, Rusia

Alamat email: popovam@piboc.dvo.ru (Popov A.)

Untuk mengutip artikel ini: Popov A., Artyukov A., Krivoshapko O., Kozlovskaya E. Aktivitas Biologis Peptida Kolagen Diperoleh oleh Hidrolisis Enzim dari Far-Eastern Holothurians. American Journal of Biomedical and Life Sciences. Vol. 1, No. 1, 2013, hlm. 17-26. doi: 10.11648 / j.ajbls.20130101.14

Abstrak: Teripang tertentu adalah hewan laut yang penting sebagai sumber makanan yang lezat bagi manusia. Selain itu sejumlah senyawa aktif biologis dan farmakologis yang unik telah dianggap berasal dari berbagai spesies teripang. Dalam karya saat ini peptida kolagen (CPs) dari tubuh holothurians timur laut (teripang) Apostichopus japonicus dan Cucumaria japonica dengan diobati dengan kompleks enzim proteolitik dari kepiting Kamchatka Paralithoda camtschaticus diperoleh, dan antitumor, antikoagulan, anti -inflammatory, dan penyembuhan luka yang diperkirakan CPs ini. Elemen dan analisis asam amino CPs dari trepang dan cucumaria disarankan bahwa hal itu dapat dianggap sebagai fragmen kolagen khas yang mengandung 6% karbohidrat sulfat dan / atau residu asam amino. CPs menghambat pertumbuhan dan perkembangan tumor Erlich yang solid, namun tidak dalam derajat yang sama. Hasil kami menunjukkan dengan jelas, bahwa CPs ini memiliki aktivitas antikoagulan moderat, dan merupakan penghambat preferensial dari hubungan awal sistem koagulasi darah. Kami juga menentukan bahwa CPs menunjukkan efek penyembuhan luka yang signifikan terkait dengan luka termal dan memiliki aktivitas antiinflamasi yang tinggi dengan menggunakan model carrageenane peradangan akut. Ternyata, bahwa tingkat aktivitas biologis bergantung pada karakteristik komposisi asam amino dan konsentrasi CP. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa CPs dari teripang memiliki aktivitas biologis yang serupa dengan peptida kolagen lainnya (komponen matriks ekstraselular, endostatin dan lainnya) dan polisakarida sulfat. Kami mengusulkan agar CPs yang diperoleh dapat diterapkan sebagai komponen makanan fungsional dan solusi antioksidan yang tidak beracun untuk pencegahan dan pengobatan berbagai penyakit.
Kata kunci: Peptida Bioaktif, Peptida Kolagen, Ketimun Laut, Obat Laut, Makanan Fungsional, Aktivitas Biologis

1. Pendahuluan

Dalam beberapa dekade terakhir, teripang telah mendapatkan popularitas di kalangan peneliti tidak hanya karena nilai gizi mereka, tetapi juga karena potensi manfaat kesehatan dan penggunaan terapeutiknya. Ada beberapa kelompok penelitian yang terlibat dalam melakukan studi pendahuluan tentang imunomodulator, antiangiogenik, antikoagulan, antikanker, penghambat enzim pengubah angiotensin-I, antiradang dan antitumor, dan lain-lain, aktivitas teripang. Kelimpahan zat aktif biologis, terisolasi dari teripang, seperti glikosida triterpen, sondonida, kondroitin sulfat, lektin, heparin, serberosida, ganglosida, sterol dan asam lemak omega-3 omega-3, dan juga protein hidrolisat dan peptida bioaktif. menunjukkan beberapa efek farmakologis yang berguna [1-6].

Fragmen protein makanan yang mengandung urutan peptida bioaktif dapat memberikan efek fisiologis dalam tubuh. Rantai pendek asam amino ini tidak aktif dalam urutan protein induk, namun dapat dilepaskan saat pencernaan pencernaan, pengolahan makanan, atau fermentasi. Banyak peptida bioaktif diperoleh dengan hidrolisis enzimatis protein kolagen, dan aktivitas kuratif spektrum luas peptida kolagen (CPs) ditentukan [7, 8].

Dalam lima belas tahun terakhir, produk transformasi enzimatik beberapa kolagen manusia telah menarik perhatian para periset dengan aktivitas antitumornya yang signifikan. Telah ditetapkan bahwa paparan endostatin yang berkepanjangan, fragmen C-terminal kolagen XVIII manusia, menghambat, melalui induksi apoptosis sel endotel, pertumbuhan pembuluh darah yang memberi makan tumor dan menciptakan kondisi untuk metastasis sel mereka. Setelah perawatan, perkembangan tumor tidak diperbaharui; Kondisi tumor ini disebut “tidur.” Sifat antiangiogenik yang diucapkan dari endostatin memungkinkan digunakan untuk mengobati protein kolagen sebagai agen potensial untuk pendekatan baru terhadap pengobatan tumor [9]. Prospek penggunaannya dapat menjadi pengembangan terapi kombinasi dengan sitostatika yang secara langsung menghambat pertumbuhan dan pembagian sel tumor [10].

Dalam praktik medis, untuk pencegahan komplikasi tromboemboli pada pasien kanker yang berisiko terkena kekurangan kardiovaskular, heparin, polisakarida dari hewan yang memiliki sulfasi tinggi, banyak digunakan sebagai obat antikoagulan dan antitrombogenik. Efek heparin pada perkembangan dan metastasis tumor tetap tidak jelas; banyak data klinis sangat kontradiktif [11]. Selain itu, heparin memiliki keterbatasan dan efek samping tertentu, seperti munculnya ketergantungan obat, alergi, dan trombositopenia. Penelitian sedang dilakukan mengenai kemungkinan penggunaan senyawa alami lainnya, misalnya polisakarida dan peptida sulfat, yang efek antikoagulan dan trombolitiknya sebanding dengan efek heparin, sebagai antikoagulan; mereka juga memiliki dan kegiatan bermanfaat lainnya. Dalam hal ini, fucoidans dari ganggang coklat laut [12], heparinomimetik dari udang laut [13], glikosaminoglikan [14], dan CPs yang berasal dari echinoderma [8] mengungkapkan efek antitrombotik, dan beberapa di antaranya dapat menjadi kepentingan sebagai perspektif potensial. agen antikoagulan

Sebagian besar penyakit memiliki etiologi yang mendasari yang melibatkan peradangan. Peradangan menjadi masalah adalah ketika agen sebenarnya tidak terselesaikan dan tubuh tidak bisa menyelesaikan respons inflamasi. Oleh karena itu beralih dari peradangan akut ke kronis tercipta masalah kesehatan. Peptida bioaktif dari makanan laut yang berharga seperti protein hidrolisat dan CPs memiliki efek perlindungan dan koreksi terhadap fungsi organisme berdasarkan pemodelan eksperimental patologi yang berbeda, yang terkait dengan peradangan kronis [2, 7, 8, 15, 16].

CP, yang diisolasi dari matriks ekstraselular, memiliki sifat penyembuhan pengatur dan penyembuhan luka, ikatan spesifik dengan reseptor glikoprotein dari matriks ini. Mekanisme ini memainkan peran penting dalam matriks penataan kembali dalam menanggapi peradangan akut, dan juga dalam kasus penyembuhan luka [17]. Jadi, kolagenase, diisolasi dari Clostridium histolyticum, membantu penyembuhan luka. Degradasi matriks ekstraselular dengan kolagenase bekas dibuat dari fragmen kolagen bioaktif, yang dapat merangsang reaksi seluler, yang diarahkan pada reparasi dan angiogenesis jaringan yang rusak [18]. Studi ini membantu memahami mekanisme molekuler penyembuhan luka, diinduksi dan dikendalikan oleh CPs.

Namun, terlepas dari keberhasilan, yang dicapai dalam mempelajari CPs aktif secara biologis dari hydrobiontes laut, meneliti persenjataan aktivitas farmakologis mereka yang lain sangat tidak mencukupi. Oleh karena itu, lakukan pencarian aktif CPs baru yang efisien dari beragam jenis makanan laut dengan menggunakan metode baru yang dihasilkannya.

Kami menyajikan menarik untuk penelitian antitumor, antikoagulan, anti-inflamasi, dan penyembuhan luka sifat CPs.

Saat ini kami mengembangkan perolehan teknologi peptida kolagen dari dua spesies holothuria komersial timur laut (teripang) Apostichopus japonicus dan Cucumaria japonica yang mendiami Laut Jepang, dan aktivitas biologis terutama antitumor, antikoagulan, anti radang dan luka. Efek penyembuhan CPs yang terisolasi ini dipelajari. Menariknya, spesies holothuria ini banyak digunakan di kawasan Asia Pasifik, sebagai produk makanan lezat, dan diaplikasikan dalam pengobatan, sebagai pengobatan medis dan profilaksis yang sangat membantu, terutama pada penyakit imunologis dan onkologis [1, 19].

2. Bahan-bahan dan metode-metode

Kami mengembangkan dan mematenkan sebuah metode (Paten no 2302250, terdaftar dalam Register Penemuan RF pada tanggal 10 Juni 2007) untuk mendapatkan fragmen polipeptida protein kolagen dari badan timun laut dengan menggunakan kompleks “Kolagenase KK” enzim proteolitik dari hepatopancreas dari kepiting Kamchatka Paralithodes camtschaticus (Immunopreparat, Rusia) selama 3,5-4,5 jam pada pH 7,5 dan suhu 35-37 ° C. Produk fermentolisis dilarutkan dalam air dan diendapkan dengan asam; endapan dipisahkan dengan sentrifugasi pada 3000 rpm selama 30 menit dan dilarutkan dalam 0,05-0,1 l larutan natrium bikarbonat. Larutan yang diperoleh yang mengandung CPs diproses dengan cara dialisis dan ultra filtrasi menggunakan membran 15 kDa, kemudian disterilisasi dan dikeringkan. Produk akhir adalah sediaan CPs terliofilik dari mentimun Apostichopus japonicus dan Cucumaria japonica; Persiapannya sangat larut dalam air dan cairan biologis.

Komposisi asam amino CPs dari mentimun laut dihitung pada analisis asam amino Biochrome 30 (Inggris). Kandungan karbohidrat dari peptida ini diukur sesuai dengan prosedur yang dijelaskan oleh Prange et al. [20].

Investigasi spektrometrik massa dilakukan pada waktu yang dibantu matriks spektrometer massa penerbangan (MALDI-TOF MS, Bruker Biflex III) (Jerman) dilengkapi dengan desorpsi laser dan ionisasi sampel. Asam sinapinat (Fluka,> 99% murni) digunakan sebagai matriks. Terjadinya struktur kolagen asli dalam sediaan ini didaftarkan dengan metode spektroskopi CD [21].

Spektrum CD larutan berair dari kolagen asli (C = 1 – 2 mg / ml) mencatat 190-250 nm dalam spektrometerogram Jasco J-500A (Jepang). Elipsis dalam spektrum CD diukur untuk residu asam amino rata-rata dengan rumus:

[θ] = [θ] obs. S × 110 / 10Cl, (1)

dimana [θ] obs. adalah nilai yang diamati dalam spektrum CD pada panjang gelombang yang diberikan; S adalah skala kepekaan perangkat di kelas; 110 Da adalah berat molekul rata-rata residu asam amino; C, adalah konsentrasi CPs, mg / ml; dan l, ketebalan cuvette, sm.

Kandungan mikro dan makroelemen (S, K, Ca, Fe, Zn, dan Br) ditentukan dengan metode analisis fluoresensi X-ray [22]. Kehadiran kelompok sulfat di PC ini dikonfirmasi dengan penentuan langsung kelompok sulfat [23].

Investigasi dengan penggunaan hewan percobaan dilakukan sesuai dengan peraturan praktik laboratorium (GLP), Orde No. 267 Kementerian Kesehatan Federasi Rusia pada tanggal 19 Juni 2003. Tentang Persetujuan Aturan Praktek Laboratorium dan Instruksi pada Studi Percobaan (Preclinical) tentang Persiapan Farmakologis Baru (2005). Percobaan dilakukan pada tikus bebas patogen dari jalur CD-1 dan CBA dengan berat 20 ± 2 g dari Pembibitan Pushchino untuk Hewan Laboratorium dan dibesarkan di vivarium Institut Kimia Bioorganika Pasifik (PIBOC, FEB RAS) (Sertifikat tersedia ). Hewan uji disimpan sesuai dengan peraturan yang diterima oleh Konvensi Eropa untuk perlindungan vertebrata yang digunakan untuk tujuan eksperimental dan ilmiah lainnya (Strasbourg, 1986); mereka menjadi sasaran euthanasia, mengikuti Aturan Melakukan Penelitian Menggunakan Hewan Eksperimental, disetujui oleh Kementerian Kesehatan dan Pembangunan Sosial Federasi Rusia.

Toksisitas “Akut” diuji pada tikus putih dan tikus menggunakan injeksi intraperitoneal tunggal, subkutan atau pemberian oral per oral. Berdasarkan data kematian hewan, dosis mematikan 50% ditentukan (LD50) [24].

Evaluasi aktivitas antitumor CPs pada variasi ascitic dan solid dari tumor Erlich dilakukan untuk tikus bebas patogenik allogenik dari jalur CD-1 [24].

Dalam kasus model padat, tumor ditransplantasikan oleh inokulasi subkutan oleh 3 × 106 sel tumor asketis. Kontrol dan uji kelompok hewan termasuk masing-masing 10-12 tikus. CPs dari teripang disuntikkan secara subkutan dalam dosis 10, 20, dan 40 mg / kg pada jarak 3 cm dari tumor, pada hari ke 7 setelah inokulasi dan selama 10 hari berikutnya setiap hari. Pada hari ke 20, hewan dengan tumor padat terkena euthanasia; Tumor dilapisi dan ditimbang. Efek antitumor diestimasi dengan menghambat pertumbuhan tumor (ITG,%) dibandingkan dengan kontrol.

Pengobatan hewan dengan tumor asketis dimulai di hari berikutnya setelah transplantasi intraperitoneal sel tumor 5x 106. Kontrol dan uji kelompok hewan masing-masing berisi sepuluh tikus. CPs dari teripang disuntikkan secara intraperitoneal dalam dosis 10, 20, dan 40 mg / kg. Efek antitumor diperkirakan oleh peningkatan rentang umur rata-rata (LSI,%) dibandingkan dengan kontrol dengan rumus:

LSI = (T / C) × 100%, (2)

dimana T dan C adalah nilai rata-rata rentang kehidupan hewan percobaan pada kelompok uji dan kontrol, masing-masing (dalam hari).

Hasil yang diperoleh diolah dengan menggunakan kriteria non-parametrik Wilkoxon-Mann-Whitney (U). Perbedaannya signifikan pada P <0,05.

Selama penelitian aktivitas antiinflamasi peradangan lokal nonspesifik diinduksi dengan pemberian 1 mg garam (100 ?l) delta-carrageen tipe IV (Sigma, AS) untuk alas kaki tikus tikus Ciak berat 19-22 g, seperti yang dijelaskan sebelumnya [25 ].

Pemodelan luka termal dilakukan sesuai [25]. Secara singkat, untuk pengukuran dimensi pada luka diaplikasikan slip penutup, dan pada mereka disalin batas luka. Cover-slip dengan batas luka yang disalin didigitasi dengan menggunakan pemindai untuk file grafis. Area luka ditentukan dengan menggunakan program Adobe Photoshop CS (versi 8.0).

Efek CPs pada sistem haagostasis koagulasi dinilai secara in vitro dengan parameter berikut: (1) waktu koagulasi seluruh darah yang tidak distabilkan; (2) berdampak pada tahap awal uji koagulasi darah untuk menentukan waktu protrombin dan waktu tromboplastin parsial teraktivasi (APTT); (3) berdampak pada tahap akhir koagulasi darah dalam pengujian penentuan waktu trombin koagulasi plasma rekalifikasi. Untuk menganalisis aktivitas antikoagulan, diperoleh plasma trombosit manusia, distabilkan dengan injeksi larutan natrium sitrat 3,8% dengan perbandingan 9: 1.

Koefisien penghambatan koagulasi seluruh darah uji tikus yang tidak distabilkan ditentukan oleh hubungan waktu pembentukan gumpalan setelah penambahan persiapan yang dipelajari sampai saat koagulasi pada sampel kontrol. Waktu protrombin ditentukan sesuai dengan rekomendasi dari produsen kit (Tekhnologiya-Standart, Rusia) pada saat koagulasi plasma rekalifikasi setelah penambahan tromboplastin jaringan dari aktivitas yang ditentukan (Tekhnoplastin, Rusia). Hasilnya dinyatakan dalam hitungan detik, dan nilai indeks protrombin (PTI,%). Perhitungan PTI dibuat dengan rumus:

PTI = (A / B) × 100%, (3)
Dimana (A) adalah aktivitas tromboplastin (20 s) yang diketahui dan (B) adalah waktu protrombin plasma yang diteliti

Waktu APTT dan trombin ditentukan dengan penggunaan kit diagnostik (Olivex, Rusia). Hasilnya dinyatakan dalam hitungan detik, membandingkan waktu pembekuan plasma darah dalam kontrol dan sampel uji. Dalam semua tes untuk penentuan sifat antikoagulan, setiap dosis sediaan diuji setidaknya tiga sampai empat kali.

Untuk penilaian perbandingan aktivitas antikoagulan CPs dari teripang, kami menggunakan polisakarida tersulfasi: galaktan sulfat – karaginan dari alga merah Chondrus pinulatus [26], fucoidans 1 dan 2 diekstraksi dari Fucus evanescens dan Laminaria cichorioides, masing-masing [27], dan heparin komersial (ICN, USA) sebagai persiapan perbandingan.

Untuk pemrosesan matematis dari bahan yang diperoleh, kami menggunakan program Microsoft Excel 7 dengan menggunakan metode variasi dalam statistik dan menghitung mean aritmetik (M), mean-square deviation (C), mean error (m) dan uji t Student. Biasanya, p <0,05 dianggap berbeda secara signifikan. Hasilnya mewakili setidaknya dua sampai tiga percobaan independen.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Karakteristik Fisik-Kimia CPS

Melalui modifikasi proteolitik kolagen dari teripang Jepang trepang A. japonicus kami memperoleh CPs yang homogen, memiliki efek obat yang berbeda. Menurut data spektrometri massa MALDI, berat molekul CPs dari trepang sekitar 12 kDa (Fig. 1). CPs ini disebut sebagai “Apostatin”. Produk serupa proteolisis enzimatik protein kolagen dari cucumaria timur jauh disebut sebagai persiapan “Cucumarin”. Menariknya, analisis spektrometri massa kromato dari “Cucumarin” tidak menunjukkan puncak homogen distribusi CPs pada berat molekul.

Fig. 1. Spektrometer spektrometri kromatografi CPs dari A. japonicus, diperoleh dengan proteolisis fermentasi (persiapan yang ditunjuk dari “Apostatin”). Pada sumbu abscissas – rasio massa ion untuk mengisi; pada sumbu ordinat – intensitas relatif dari arus ion

CD-spektroskopi menunjukkan bahwa CPs dari “Apostatin” dan “Cucumarin” mempertahankan struktur kolagen asli: ini ditunjukkan oleh adanya spektrum CD-nya dari pita negatif elipsis tinggi di wilayah 200 nm [21] .

Persiapan “Apostatin” dan memiliki komposisi kimia berikut, dalam%: protein, 54,18; monosakarida, 10.91; abu, 18,41; sulfat, 6,49; kelembaban, 7,49; dan komponen lainnya, 2,52. Pada hasil analisis elemen ada alasan bagus untuk percaya bahwa CPs dapat mengandung residu karbohidrat dan / atau residu asam sulfat [23].

Untuk mengakses karakteristik struktural “Apostatin” dan “Cucumarin”, kami memeriksa komposisi asam amino CPs ini (lihat Tabel 1). Perbandingan komposisi asam amino CPs dari trepang dan cucumaria menunjukkan kandungan asam amino negatif yang lebih tinggi (asam aspartik dan glutamat), oxyacids (dengan serum serin dan treonin selama tirosin) dan peningkatan kadar valin. CPs dari trepang kandungan glisin, hidoksiprolin, dan prolin kira-kira dalam 1,5 – 2,0 kali lebih banyak, dari pada CPs dari cucucmaria. Dengan demikian, analisis unsur dan asam amino CPs dari trepang dan cucumaria disarankan bahwa hal itu dapat dianggap sebagai fragmen kolagen khas yang mengandung 6% karbohidrat sulfat dan / atau residu asam amino [23].

Tabel 1. Analisis komparatif komposisi asam amino PC dari trepang dan cucumaria (% berat)

Setiap nilai mengekspresikan mean dari penentuan pohon. Semua nilai secara statistik signifikan (p <0,05)

Perlu dicatat bahwa endostatin, fragmen proteolitik kolagen XVIII mamalia, berbeda dengan CPs dari teripang, tidak dapat diberikan pada peptida kolagen yang khas [9].

3.2. Toksisitas

Pengujian toksisitas akut dari preparasi telah menunjukkan bahwa protein kolagen dalam larutan berair memiliki toksisitas rendah dengan injeksi oral tunggal (LD50> 3 g / kg), intraperitoneal, dan subkutan (LD50> 1 g / kg) terhadap tikus dan tikus.

3.3. Aktivitas Antitumor

Penyakit tumor – masalah pembakaran perawatan kesehatan modern seperti juga salah satu penyebab utama kematian di dunia. Menurut data WHO kasus kanker selama 25 tahun terakhir tumbuh sebesar 1,5-2,0 kali. Untuk berbagai versi kanker satu ciri umum – penyakit ini sangat sulit disembuhkan adalah karakteristik. Perlu untuk mengetahui bahwa terapi kanker sangat mahal dan sekarang tidak efektif. Pada saat yang sama dianggap bahwa sampai 40% kasus penyakit kanker adalah mungkin untuk mencegah melalui tunjangan makanan sehat yang mengandung obat pencegahan kanker dan antineoplastik alami terutama bioflavonoid, antioksidan, peptida dan komponen alami lainnya.

Teripang mengandung berbagai bahan antitumor. Komponen aktif antitumor ini memiliki aksi penghambatan dalam berbagai tahap perkembangan, perkembangan tumor dan metastasis. Eksplorasi bahan aktif antitumor dari teripang mungkin membuka jendela peluang untuk menemukan agen antitumor baru dari sumber kelautan lainnya untuk pengobatan tumor klinis [1, 5].

Dalam konteks ini, produk transformasi fermentasi protein kolagen sudah lama menarik perhatian para peneliti aktivitas antitumor yang signifikan. Jadi, terinstal bahwa pengaruh panjang fragmen protein kolagen XVIII manusia – endostatin menyebabkan apopotosis sel endotelial dan menghambat pertumbuhan pembuluh darah, memasok tumor dan menciptakan kondisi untuk metastasis selnya [9]. Mengindikasikan sifat antiangiogen dari endostatin memungkinkan mempertimbangkan beberapa PC sebagai agen potensial pada pengobatan tumor. Prospek penggunaan PC disimpulkan dalam menggunakannya secara multifungsi bersamaan dengan sitostatika, menghambat pertumbuhan dan pembagian sel tumor [10].

Dengan menggunakan enzim proteolitik kompleks “Kolagenase ??” dari kepiting Paralithoda camtschaticus, kami berhasil mengisolasi CPs dari trepang “Apostatin” dan cucumaria “Cucumarin” selama penelitian tentang sifat antitumor.

Dalam serangkaian percobaan tentang aktivitas antitumor “Apostatin” secara in vivo, kami menemukan dosis terapeutik yang optimal sehubungan dengan variasi padat dan asites tumor Ehrlich. Ditemukan bahwa dalam dosis 10 sampai 40 mg / kg, “Apostatin” memberi efek penghambatan dosis bergantung pada pertumbuhan tumor padat. Massa tumor rata-rata pada kelompok kontrol hampir dua kali lebih tinggi (P <0,05) dibandingkan pada kelompok percobaan tikus yang mendapat terapi dengan CPs yang diuji dengan dosis 20 mg / kg. Nilai rata-rata massa tumor adalah 1252 ± 234 mg pada kontrol dan 698 ± 125 mg pada kelompok eksperimen.

Perlu dicatat bahwa dalam percobaan pada model tikus padat Walker 256 carcinosarcoma, “Apostatin” disuntikkan secara intraperitoneal selama 7 hari pada 20 mg / kg secara signifikan (P <0,05) meningkatkan efek antitumor dan antimetastatik dari obat sitostatik yang terkenal. siklofosfat [28].

“Cucumarin” juga dalam dosis 40 mg / kg diberikan efek penghambatan positif pada pertumbuhan tumor padat Ehrlich: tumor pertumbuhan penghambatan adalah 34,2 ± 4,8%, bila dibandingkan dengan kelompok yang tidak diobati (P ??<0,05)

Dalam kasus tumor asites Ehrlich, persiapan “Apostatin” kurang efisien. Lebih dari sepuluh kursus pengobatan, hal ini menyebabkan peningkatan umur rata-rata yang signifikan (P> 0,05) sebesar 29,4 ± 3,2% dibandingkan dengan kontrol hanya pada 40 mg / kg. Persiapan “Cucumarin” dalam dosis 10 sampai 40 mg / kg tidak aktif dalam kondisi percobaan ini.

Hasil penelitian kami tentang CPs dari persiapan trepang (persiapan “Apostatin”) dan cucumaria (persiapan “Cucumarin”) ada dalam kesepakatan yang baik dengan banyak data tentang endostatin dan berbagai polisakarida sulfat, yang umumnya hanya menunjukkan sedikit atau tidak ada efek menghambat terhadap asites. tumor. Hal ini kemungkinan terkait dengan efek antiangiogenik yang dominan dari senyawa di atas pada pertumbuhan tumor padat [9, 10, 13].

3.4. Aktivitas Antikoagulan

Studi sifat antikoagulan CPs dari A. japonicus menunjukkan bahwa penambahannya terhadap darah murine yang tidak stabil dalam dosis lebih besar dari 25 ?g / ml menyebabkan peningkatan waktu penggumpalannya (maksimum pada 63,1 ± 3,2 ?g / ml). Efek yang sama diamati dengan penambahan 0,035 ME / ml atau 1,4 ± 0,2 ?g / ml heparin, yang menunjukkan aktivitas antikoagulan moderat CPs dari persiapan trepang (“Apostatin”).

Setelah penambahan tromboplastin jaringan ke plasma trombosit plasma yang stabil, yang memicu jalur pembekuan darah di luar, efek antikoagulan dari preparasi “Apostatin” telah dicatat pada 0,1 mg / ml (PTI = 64,2 ± 4,3%) dan aktivitas meningkat lebih lanjut. pada 0,4 mg / ml. Nilai antikoagulan yang serupa juga ditemukan pada CPs dari cucumaria dan polisakarida sulfat fukoidan 1 (Fig. 2a). Efek fucoidan 2 dari alga L. cichorioides coklat sebanding dengan heparin, dan pada dosis 0,4 mg / kg, fukoid 2 benar-benar mencegah pembekuan darah.

Untuk perbandingan antara CPs yang diuji dan preparat lainnya, pembekuan darah oleh mekanisme internal yang diinduksi pada organisme pada kontak darah dengan subendothelium dinilai dalam uji APTT dengan menambahkan kaolin sebagai permukaan luar ke plasma. Pada 0,4 mg / ml, semua senyawa yang diuji menyebabkan pengurangan lebih dari 3 menit pada waktu pembekuan plasma (Fig. 2b). Penurunan empat kali lipat dalam dosis “Apostatin” mengurangi aktivitas antikoagulannya, seperti juga halnya dengan polisakarida, karagenan, dan fukoid 1. Setelah penambahan CPs 0,1 mg / ml, waktu pembekuan plasma rekalifikasi meningkat 2,7 ± 0,3 kali, dibandingkan ke plasma normal. Seperti pada percobaan sebelumnya, dinamika aktivitas antikoagulan yang serupa dalam kaitannya dengan dosis ditemukan untuk “Apostatin” dan fucoidan 1, serta heparin dan fucoidan 2. Kami mencatat bahwa efek “Cucumarin” pada pembekuan darah dalam uji APTT adalah sebanding dengan “Apostatin” (Fig. 2b

Uji waktu trombin (Fig. 2c), yang mengukur tahap akhir pembekuan plasma, menunjukkan bahwa hanya polisakarida sulfat dengan dosis 0,4 mg / ml memiliki efek penghambatan pada pembentukan bekuan fibrin. Persiapan CPs dari teripang A. japonicus dan C. japonica tidak menunjukkan aktivitas yang signifikan (P> 0,05).

Untuk perbandingan antara CPs yang diuji dan preparat lainnya, pembekuan darah oleh mekanisme internal yang diinduksi pada organisme pada kontak darah dengan subendothelium dinilai dalam uji APTT dengan menambahkan kaolin sebagai permukaan luar ke plasma. Pada 0,4 mg / ml, semua senyawa yang diuji menyebabkan pengurangan lebih dari 3 menit pada waktu pembekuan plasma (Gambar 2b). Penurunan empat kali lipat dalam dosis “Apostatin” mengurangi aktivitas antikoagulannya, seperti juga halnya dengan polisakarida, karagenan, dan fukoid 1. Setelah penambahan CPs 0,1 mg / ml, waktu pembekuan plasma rekalifikasi meningkat 2,7 ± 0,3 kali, dibandingkan ke plasma normal. Seperti pada percobaan sebelumnya, dinamika aktivitas antikoagulan yang serupa dalam kaitannya dengan dosis ditemukan untuk “Apostatin” dan fucoidan 1, serta heparin dan fucoidan 2. Kami mencatat bahwa efek “Cucumarin” pada pembekuan darah dalam uji APTT adalah sebanding dengan “Apostatin” (Gambar 2b

Uji waktu trombin (Gambar 2c), yang mengukur tahap akhir pembekuan plasma, menunjukkan bahwa hanya polisakarida sulfat dengan dosis 0,4 mg / ml memiliki efek penghambatan pada pembentukan bekuan fibrin. Persiapan CPs dari teripang A. japonicus dan C. japonica tidak menunjukkan aktivitas yang signifikan (P> 0,05).

Gambar 2. Studi komparatif peptida kolagen dan polisakarida sulfat pada sistem hemostasis koagulasi pada tes: (a) – waktu protrombinik, pada%, (b) – waktu tromboplastinat parsial teraktivasi, dalam hitungan detik, (c) – waktu trombin, detik: 1 – Kontrol; 2 – “Apostatin”; 3 – “Cucumarin”; 4 – karaginan; 5 – fucoidan-1; 6 – fucoidan-2; 7 – heparin Dalam kasus (c) dosis semua persiapan yang dipelajari adalah 0,4 mg / ml. Semua nilai ditentukan seperti yang dijelaskan pada Bagian 2. Kolom, rata-rata percobaan independen pohon; bar, SD

Hasil ini dengan jelas menunjukkan bahwa gangguan pembekuan plasma darah yang diamati pada tiga tes dasar dengan penambahan heparin dan fucoidans bukanlah karakteristik persiapan “Apostatin” dan “Cucumarin”.

Berbeda dengan polisakarida tersulfasi, yang menghambat faktor aktif yang didominasi dari cara pembekuan internal dan secara substansial memperkuat efek antitrombin factor III, “Apostatin” dan “Cucumarin” tidak menghambat aktivitas enzimatik trombin dan, akibatnya, pembentukan trombus fibrin .

Perlu dicatat bahwa agen antitrombogenik lain yang diketahui saat ini dari sifat protein, yaitu, hirudin dan turunannya, memiliki afinitas tinggi dan spesifisitas yang tinggi terhadap trombin dan merupakan penghambat langsungnya [29].

Kami menekankan bahwa kontras dengan “Apostatin” (Gambar 1), “Cucumarin” tidak menampilkan puncak protein yang jelas namun memiliki aktivitas antikoagulan serupa. Tingkat ekspresi aktivitas antikoagulan agen yang diteliti meningkat dengan urutan sebagai berikut: karaginan <“apostatin” dan “Cucumarin” ? fucoidans <heparin.

Keanehan efek antikoagulan dan antitumor dari “Apostatin” dan “Cucumarin” mungkin terjadi karena adanya struktur residu sulfat bermuatan negatif, yang kepentingan fisiologisnya untuk senyawa yang berbeda dikonfirmasi oleh data literatur [13]. Tingkat sulfasi yang meningkat disertai dengan peningkatan aktivitas antiangiogenik dan antikoagulan yang signifikan [30].

Aktivitas antikoagulan dan antitumor, adanya kelompok sulfat dalam strukturnya, dan toksisitasnya yang rendah mungkin menyarankan mekanisme aktivitas biologis “Apostatin” dan “Cucumarin” yang serupa dengan polisakarida sulfat dan produk transformasi proteolitik kolagen XVIII, yaitu , protein endostatin. Dengan struktur kimianya, kolagen XVIII termasuk dalam proteoglikan sulfat heparan, yang mengandung rantai karbohidrat yang sangat sulfat yang sensitif terhadap heparinase [31]. Oleh karena itu sangat mungkin endostatin memiliki residu karbohidrat sulfat dalam strukturnya dan memiliki aktivitas antikoagulan. Sifat antikoagulan dari makromolekul sulfat bergantung pada ciri struktural rantainya: komposisi karbohidrat, derajat sulfasi, distribusi dan densitas muatan, serta ukuran dan tingkat percabangan [30, 32]. Namun, endostatin, serta polisakarida sulfat, memiliki spektrum aktivitas biologis yang jauh lebih luas. Dengan toksisitas akut pada dosis lebih dari 500 mg / kg dan sitotoksisitas lemah pada sel tumor secara in vitro, senyawa ini menampilkan aktivitas antitumor, antimetastatik, dan antiangiogenik yang diucapkan [10, 13]. Kami menduga bahwa CPs dari trepang dan cucumaria memiliki residu karbohidrat dan / atau residu asam sulfat dalam struktur molekulnya menggabungkan sifat endostatin protein dan polisakarida sulfat dalam aktivitas biologisnya.

Temuan kami sesuai dengan laporan terakhir, yang menunjukkan efek antitrombotik dari glycosaminoglycan yang berasal dari mentimun laut (GAG) [14]. Fungsi GAG analog dengan dermatan sulfat, baik dalam hal kemanjuran dan mekanisme aksi antitrombotik. Selanjutnya, telah ditunjukkan bahwa colt lysis oleh GAG dikendalikan oleh kapasitasnya untuk meningkatkan aktivitas plasmin, untuk menghambat polimerisasi monomer fibrin, yang berakibat mengubah arsitektur jaringan fibrin. Dapat diklaim bahwa efek pada sel endotel vena umbilikalis manusia terwujud pada tingkat transkripsi dan dengan demikian mungkin bertanggung jawab atas atribut antitrombotik GAG. Temuan penelitian ini menunjukkan bahwa GAG yang berasal dari mentimun memiliki aktivitas antikoagulan secara in vivo dan dapat digunakan sebagai obat yang menjanjikan untuk terapi antitrombotik [14].

Pertanyaan yang cukup masuk akal – apakah menyimpan ?Ps dari teripang ini, diperoleh dengan dekomposisi fermentasi protein kolagen, sifat antikoagulan dalam tes in vivo pada peritoneal, intramuskular dan per os mode pendahuluan.

Kami ditunjukkan, bahwa tindakan “Apostatin” pada koagulilitas darah di bawah administrasi per os bergantung pada konsentrasi dan waktu yang diperkenalkan untuk eksposisi. Ketika “Apostatin” diperkenalkan per os dalam dosis dari 25 sampai 200 mg / kg, berlangsung asimilasi cepat dari persiapan ini menjadi hewan percobaan darah (tikus). Aktivitas antikoagulan indeks akuntansi “Apostatin” (rasio waktu pembekuan darah pada tes yang dialami untuk dikendalikan) dalam diperkenalkan per os dalam dosis 50 dan 100 mg / kg sampai rata-rata sekitar 1,5 dan 2,0. Perlu dicatat bahwa aktivitas antikoagulan “Apostatin” pada pemberian administrasi intraperitoneal dan intramuskular lebih banyak mengekspresikan, daripada pada per os.

Dengan demikian, “Apostatin” in vivo pada administrasi per os memiliki aktivitas antikoagulan moderat. Fakta ini menunjukkan bahwa di bawah penyerapan “Apostatin” yang melewati sistem saluran pencernaan tidak menjadi sasaran pencernaan yang menyelamatkan sifat antikoagulan mereka sendiri, hal itu sangat penting untuk penyembuhan potensial dan komponen aktif dari makanan fungsional.

3.5. Aktivitas Anti-Inflamasi

Aktivitas antiinflamasi CPs diperkirakan dengan menggunakan model carrageenane edema footpad, metode yang mudah digunakan untuk menilai respons inflamasi terhadap iritasi. Biasanya, senyawa uji dinilai untuk aktivitas antiinflamasi akut dengan memeriksa kemampuan mereka untuk mengurangi atau mencegah pengembangan pembengkakan kumbang karaginan. Model ini telah lama digunakan untuk menilai sifat anti-inflamasi agen seperti obat anti-inflamasi nonsteroid yang menghambat produksi prostaglandin.

Dalam serangkaian percobaan dipelajari persiapan CPs “Cucumarin” dan “Apostatin” dibandingkan dengan obat antiinflamasi nonsteroid yang terkenal oleh indametasin. Hasil yang diperoleh ditunjukkan pada tabel 2.

“Cucumarin” dan “Apostatin” pada pemberian peritoneal dalam dosis 10 dan 20 mg / kg memiliki aktivitas antiinflamasi yang cukup tinggi: mereka menghambat edema pembentukan padfoot edema pada kisaran 30 – 47%, namun persiapan indometecin (dalam dosis 10 mg / kg) pada 52,0 ± 4,06%, dibandingkan dengan kontrol. Pada dosis 10 mg / kg aktivitas tertinggi ditunjukkan untuk persiapan “Cucumarin” (sekitar 46%).

Tabel 2. Efek antiinflamasi CPs dari teripang dengan pemodelan radang akut

Perlu dicatat bahwa dalam kasus tertentu dosis 20 mg / kg akibat efek perlindungan yang lebih rendah, kemudian dosis 10 mg / kg, yang menyarankan agar penelitian lebih lanjut mengenai potensi antiinflamasi preparat CPs yang diuji dengan menggunakan dosis medis yang lebih rendah.

Dengan demikian, olahan “Cucumarin” dan “Apostatin” dari yang ditunjukkan di atas spesies teripang di rute peritoneal administrasi memiliki aktivitas antiinflamasi yang secara farmakologis mengurangi perkembangan pembengkakan cakar karaginan pada tikus.

Dalam penelitian baru-baru ini ditemukan [16], bahwa persiapan oligopeptida laut (MOP) diperoleh dari Salmon Chum (Oncorhynchus keta) dengan metode hidrolisis enzimatik, untuk memiliki properti radioprotektif melalui stimulasi imunosupresi akibat radiasi. MOP secara signifikan meningkatkan jumlah sel darah putih setelah penyinaran, dan menurunkan kerusakan oksidatif akibat radiasi. Efek ini dapat disebabkan oleh augmentasi aktivitas enzim antioksidan, seperti superoxidedismutase dan glutathioneperoxydase, pengurangan peroksidasi lipid (tingkat dialdehida malal) di hati, dan perlindungan terhadap apoptosis akibat radiasi. Oleh karena itu, penulis mengusulkan bahwa MOP digunakan sebagai antioksidan ideal untuk mengurangi kerusakan oksidasi akibat radiasi pada pasien kanker [16].

Sebelumnya juga dilaporkan bahwa ketimun laut mengandung senyawa polifenol, yang memiliki pemulung radikal bebas dan aktivitas antiinflamasi. Jadi, ekstrak air yang berasal dari teripang (Holothuria leucospilota, Holothuria scabra, Stichopus chlorontus) mengandung jumlah fenolat total yang secara signifikan lebih tinggi (4,85-9,70 mg asam gallat equivalent / GAE) / g dw) dibandingkan ekstrak organik (1,53-2,90 mg GAE / g dw). Demikian pula, kandungan fenol dan flavonoid total di berbagai bagian termasuk saluran pencernaan, gonad, otot, dan alat pernapasan teripang, Cucumaria frondosa, bervariasi dari 22,5 sampai 236,0 mg GEA / g dw, dan 2,9 sampai 59,8 mg rutin ekuivalen / g dw, masing-masing.

Kita dibenarkan untuk mempertimbangkan bahwa CPs dari mentimun A. japonicus dan C. japonica membuat kumpulan agen antiinflamasi dari sumber bahan baku laut, dan khususnya dari teripang.

3.6. Aktivitas Penyembuhan Luka

Persiapan CPs, termasuk peptida yang disebut peptida laut, banyak digunakan dalam tata rias sebagai obat peremajaan yang efektif yang mendukung keseimbangan kelembaban pada kulit dan memasoknya dengan asam amino yang diperlukan.

Teripang dan produk berbasis mentimun laut sekarang tersedia di rak-rak toko makanan kesehatan karena efek terapeutiknya, khususnya fungsi penyembuhan luka (untuk mempercepat pemulihan luka, luka dan luka pada kulit, serta secara internal untuk bisul dan penyakit lain yang melibatkan kerusakan internal). Hal ini diyakini bahwa penggunaan langsung timun laut dapat mengurangi waktu pemulihan luka dan membantu pembentukan jaringan baru dan regenerasi manusia sama seperti kemampuan teripang untuk segera menumbuhkan jaringan tubuhnya sendiri saat rusak [33].

Jelas bahwa asam lemak mentimun (Stichopus chloronotus) termasuk asam arachidonic (AA C20: 4), asam eicosapentaenoic (EPA C20: 5), dan asam docosahexaenoic (DHA C22: 6) dapat memainkan peran potensial dalam perbaikan dan luka jaringan. penyembuhan [34]. Telah terungkap dalam literatur bahwa pengumpan sedimen bawah teripang dapat mengandung kandungan asam lemak rantai bercabang yang tinggi untuk membantu aktivitas penyembuhan luka potensial. Jumlah EPA yang cukup banyak dalam timun laut mungkin terkait dengan kemampuan echinodermata ini untuk memulai perbaikan jaringan. EPA dikenal sebagai senyawa aktif utama pada minyak ikan, dan memberikan fungsinya melalui penghambatan prostaglandin dan atribut antitrombik. Selain itu, EPA juga memainkan peran potensial dalam mekanisme pembekuan darah [34]

Seperti yang ditunjukkan pada penelitian percontohan terbaru tentang model hewan dan seluler [18], CPs yang diterima sebagai hasil tindakan fermentasi kolagenase dari bakteri C. histolyticum, memiliki kombinasi unik dari penyembuhan luka dan aktivitas pengatur. Mereka mempromosikan pemulihan kandang endotelium dan ceratinosit pada kerusakan in vitro mereka, dan juga penyembuhan luka in vivo. Fragmen yang ditentukan mendorong regenerasi cepat endotelium dan mempercepat penggantian microvessels. Menurut penulis, degradasi matriks protein kolagenase mengarah pada pembentukan fragmen bioaktif – “matrikin” yang dapat secara tajam merangsang reaksi seluler pada luka kulit dan proses angiogenesis yang memungkinkan pemahaman mekanisme molekuler penyembuhan luka yang diatur dan diinduksi oleh CP.

Mengingat fakta ini, kami memperkirakan potensi penyembuhan luka CPs dari 2 spesies teripang. Pengujian aktivitas penyembuhan luka krim, yang mengandung komponen aktif CPs ini dilakukan pada tikus non-patogen betina dari garis CBA yang menyebabkan luka termal. Krim komersial “Methyluracyl” digunakan sebagai persiapan perbandingan.

Hasil diberikan pada tabel 3. Dari analisis data yang diberikan dalam tabel, nampaknya “Cucumarin” dan “Apostatin” (persiapan 1%) sebagai komponen obat krim memiliki tindakan penyembuhan luka yang diungkapkan, mengurangi waktu penyembuhan luka. . Terutama perbedaan yang jelas dalam aktivitas penyembuhan luka antara kelompok yang dipelajari dicatat untuk hari ke 7 setelah induksi luka bakar termal. Seperti yang ditunjukkan pada eksperimen, persiapan “Apostatin” efisiensi terbesar 1%, yang dirancang berdasarkan krim anak-anak memiliki efek penyembuhan yang diungkapkan (85,4 ± 7,1%) pada luka bakar termal. Efek penyembuhan luka dari persiapan 1% “Cucumarin” (80,3 ± 7,8%) dan krim obat komersial “Methylurasyl” (70,2 ± 6,2%) juga jauh lebih tinggi daripada kontrol (48,5 ± 4,2%). Hasil kami dengan jelas menunjukkan bahwa krim “Cucumarin” dan “Apostatin” menunjukkan aktivitas penyembuhan luka yang manjur yang sesuai dengan fakta, diperoleh tentang beberapa CPs lainnya.

Tabel 3. Aktivitas penyembuhan luka pada peptida dari kolagen starfish P. pectinifer

Jadi, seperti yang ditunjukkan pada penelitian ilmuwan Amerika, kolagenase yang diisolasi dari C. histolyticum, mendorong penyembuhan luka. Degradasi matriks ekstraselular dengan menggunakan kolagenase menciptakan fragmen bioaktif yang dapat merangsang reaksi seluler yang diarahkan pada reparasi dan angiogenesis. Untuk memeriksa hipotesis ini, penulis melakukan hidrasi matriks fermentasi yang terbatas dari matriks ekstraselular, yang terjadi pada endothelium kapiler tertentu, dengan menggunakan kolagenase manusia atau bakteri. Penerapan metode imunophibipitasi dengan antibodi yang diidentifikasi adalah kolagen I, II, III, IV dan V. Penerapan selanjutnya dari metode spektrometri massa memungkinkan untuk menentukan adanya fragmen matriks terdegradasi yang unik. Fragmen ini terbentuk diproses oleh bakteri, namun tidak oleh kolagenase manusia. Fragmen yang ditentukan lebih disukai untuk mempercepat penyembuhan endotelium dan mempercepat penggantian microvessels secara in vitro. Fragmen kolagen IV, fibrillin-1, tenascin, dan peptida baru dengan struktur yang belum terbentuk memiliki sifat proangiogenik yang diekspresikan. Peptida yang digunakan dalam dosis 10 sampai 100 nmol, meningkatkan kecepatan proliferasi mikrovaskular seluler menjadi endotelium sebesar 47%, dan angiogenesis secara in vitro menjadi 200% dibandingkan dengan kontrol. Penelitian ini membantu untuk memahami mekanisme molekuler penyembuhan luka yang diatur dan diinduksi oleh peptida [18]. Oleh karena itu, beberapa CPs setelah penelitian tambahan dapat direkomendasikan sebagai komponen penyembuhan luka efektif saat mengembangkan obat baru dan kosmetik.

3.7. Kesimpulan

Dengan demikian, sediaan kolagen yang diperoleh dari teripang A. japonicus dan C. japonica oleh proteolisis enzimatik memiliki spektrum aktivitas biologis yang luas. CPs ini tidak beracun, menyerap, aman bila digunakan dalam waktu lama dan memiliki sifat organoleptik positif. Ini dapat memberikan dasar untuk pengembangan sediaan obat-obatan, serta aditif makanan aktif secara biologis sebagai obat penanggulangan profilaksis dan suplemen terhadap berbagai penyakit.

Aplikasi klinis dari banyak peptida bioaktif dan CPs sangat tidak terbatas kekurangan utama seperti ketidakstabilan, kelarutan rendah, bioavailabilitas yang buruk dan metabolisme yang cepat. Pendekatan pengiriman berbasis nanoteknologi aneka telah digunakan untuk meningkatkan bioavailabilitas oral, aktivitas biologis atau kemampuan penargetan jaringan CPs. Menurut pendapat kami, ada potensi besar untuk memanfaatkan CPs yang dipelajari dari teripang untuk mengembangkan solusi baru dan makanan fungsional yang bermanfaat dengan manfaat fisiologis bagi manusia.

Ucapan Terima Kasih

Penulis berterima kasih kepada N.M. Shevchenko, T.N. Zvyagintseva dan I.M. Yermak (PIBOC FEB RAS) untuk menyediakan sampel polisakarida dari ganggang laut. Karya ini didukung oleh hibah dari Russian Foundation for Basic Research (no. 04-04-08083), dan oleh kontrak negara dari Kementerian Ilmu Pengetahuan dan Pendidikan Federasi Rusia untuk ? 16.512.11.2271.

References

[1] 
A.M. Popov, E.A. Popov, “The Secondary Metabolites from Herbs and Sea Invertebrates: The Biological activity and modes of action”, Lambert Academic Publishing, AV Akademikerverlag GmbH & Co. KG, Saarbrucken, Deutschland, 2012. pp. 240-330. 
[2] 
A.M Popov, T.I. Burtseva, I.A Lee, N.V. Semenova, E.P. Kozlovskaya, “The Effects of Balm "Herbamarin" on Functional Condition of Cardiovascular and Hepatobiliary Systems”, Biomed. Chem., 2003, vol. 49, pp. 394-400. 
[3] 
I.A. Li, A.M. Popov, A.V. Tsybul'ski?, N.M. Sanina, et al., “Immunostimulatory Characteristics of a Novel Carrier on the Basis of Cucumarioside A2-2 and Monogalactosyldiacylgycerol”, Prikl. Biokhim. Mikrobiol., 2008, vol. 44, pp. 694-700. 
[4] 
A. Tsybulsky, N. Sanina, I. Lee, A. Popov, E Kostetsky., O. Portnyagina, V. Shnyrov, “The Development of a New Adjuvant Lipid-Saponin Complex and its Use at Experimental Immunization by Bacterial Antigen”, Biochemistry (Moscow) Supplemental Series B: Biomedical Chemistry. 2007, vol. 1, pp. 353-358. 
[5] 
S. Bordbar, F. Anwar, N. Saari, “High-Value Components and Bioactives from Sea Cucumbers for Functional Foods. A Review,” Mar. Drugs, 2011, vol. 9, pp. 1761-1805. 
[6] 
I. Wijesekara, S.-K. Kim, “Angiotensin-I-Converting Enzyme (ACE) Inhibitors from Marine Resources: Prospects in the Pharmaceutical Industry”, Mar. Drugs, 2010, vol. 8, pp. 1080-1093. 
[7] 
A. M. Popov, A. A. Artyukov, O. N. Krivoshapko, Yu. P. Shtoda, T. A. Rutskova, V. P. Glazunov, E. P. Kozlovskaya, “Polyfunctional Pharmacological Properties of Collagen Peptides from Marine Echinoderms”, Rus. J. Biopharm., 2012, vol. 4, pp. 5-16. 
[8] 
A. M. Popov, A. A. Artyukov, V. P. Glazunov, E. V. Mandron, O. N. Krivoshapko, and E. P. Kozlovskaya, “Antitumor and Anticoagulant Activities of Collagen Protein from the Holothurian Apostichopus japonicas Modified by Proteolytic Enzymes”, Rus. J. Marine Biology, 2011, vol. 37, pp. 217–222. 
[9] 
T. Boehm, J. Folkman, T. Browder, and M.S. O’Reilly, “Antiangiogenic Therapy of Experimental Cancer does not Induce Acquired Drug Resistance”, Nature, 1997, vol. 390, pp. 404–407. 
[10] 
M.V. Karamouzis, and S.J. Moschos, “The Use of Endostatin in the Treatment of Solid Tumors”, Expert Opin. Biol. Ther., 2009, vol. 9, pp. 641–648. 
[11] 
S.M. Smorenburg, and C.J.F. van Noorden, “The Complex Effects of Heparins on Cancer Progression and Metastasis in Experimental Studies”, Pharmacol. Rev., 2001, vol. 53, pp. 93–105. 
[12] 
T.A. Kuznetsova, T.S. Zaporozhets, N.N. Besednova, et al., “Immunostimulating and Anticoagulating Activity of Fucoidan from the Brown Alga Fucus evanescens from the Sea of Okhotsk”, Antibiotiki i khimoterapiya, 2003, vol. 48, pp. 11–13. 
[13] 
J.L. Dreyfuss, C.V. Regatieri, M.A. Lima, et al., “A Heparin Mimetic Isolated from a Marine Shrimp Suppresses Neovascularization”, J. Thromb. Haemost., 2010, vol. 8, pp. 1828–1837. 
[14] 
Z. Li, H. Wang, J. Li, et al., “Basic and Clinical Study on the Antithrombotic Mechanism of Glycosaminoglycan Extracted from Sea Cucumber”, Chin. Med. J. (Engl.), 2000, vol. 113, pp. 706–711. 
[15] 
S. Lordan, R.P. Ross, and C. Stanton, “Marine Bioactives as Functional Food Ingredients: Potential to Reduce the Incidence of Chronic Diseases”, Mar. Drugs, 2011. v. 9. P. 1056–1100. 
[16] 
R. Yang, J. Wang, Z. Liu, et al., “Antioxidant Effect of a Marine Oligopeptide Preparation from Chum Salmon (Oncorhynchus keta) by Enzymatic Hydrolysis in Radiation Injured Mice”, Mar. Drugs. 2011, vol. 9, pp. 2304-2315. 
[17] 
H. Meisel, “Food-Derived Bioactive Proteins and Peptides as Potential Components of Nutraceuticals”, Curr. Pharm. Des., 2007, vol. 13, pp. 873–874. 
[18] 
T. N. Demidova-Rice, A. Geevarghese, and I. M. Herman, “Bioactive Peptides Derived from Vascular Endothelial Cell Extracellular Matrices Promote Microvascular Morphogenesis and Wound Healing in vitro”, Wound Repair Regen2011, vol. 19, pp. 59–70. 
[19] 
L.Yu. Savvateeva, M.G. Maslova, and V.L. Volodarsky, Dal’nevostochnye goloturii i astsidii kak tsennoe pishchevoe syr’e (Far-Eastern Holothurians and Ascidians as a Valuable Raw Material), Vladivostok: Izt. Dal. Vost. Gos. Univ., 1983. 
[20] 
A. Prange, H. Boddeker, W. Michaelis, and Z. Frezenius, “Multi-element Determination of Trace Elements in Whole Blood and Blood Serum by TXRF”, Anal. Chem., 1989, vol. 335, pp. 914–918. 
[21] 
F.R. Brown, A. di Corato, G.P. Lorenzi, and E.R. Blout, “Synthesis and Structural Studies of Two Collagen Analogues: Poly (L-Prolyl-L-Seryl-Glycyl) and Poly (L-Prolyl-L-Alanyl-Glycyl)”, J. Mol. Biol., 1972, vol. 63, pp. 85–99. 
[22] 
T.C. Miller, M.R. Joseph, G.J. Havrilla, et al., “Capillary Electrophoresis Micro X-Ray Fluorescence: A Tool for Benchtop Elemental Analysis”, Anal. Chem., 2003, vol. 75, pp. 2048–2053. 
[23] 
E.E. Gilbert, “Sulfonation and Related Reactions”, New York: Interscience, 1965. Translated under the title Sulfirovanie organicheskikh soedinenii, Moscow: Khimiya, 1969. 
[24] 
Z.P. Sofyina, A.B. Syrkin, A. Goldin, and A. Klyain, Eksperimental’nye otsenki protivoopukholevykh preparatov v SSSR i SShA (Experimental Assessments of Antitumor Preparations in USSR and USA), Moscow: Meditsina, 1980. 
[25] 
Rukovodstvo po eksperimental’nomu doklinicheskomu izucheniyu novykh farmakologicheskikh veshchestv (A Manual for Experimental (Preclinical) Study of Novel Pharmacological Substances), Khabriev, R.U., Ed., Moscow: Meditsina, 2005. 
[26] 
A.O. Barabanova, “Influence of Endogenous and Exogenous Factors on Structures and Properties of Carrageenans from the Red Algae Tichocarpus crinitus and Chondrus pinnulatus”, Abstract of Cand. Sci. (Chem.) Dissertation, Pacific 
Institute of Bioorganic Chemistry FEB RAS, Vladivostok, 2005. 
[27] 
T.N. Zvyagintseva, N.M. Shevchenko, A.O. Chizhov, et al., Water-Soluble Polysaccharides of Some Far Eastern Brown Seaweeds. Distribution, Structure, and Their Dependence on the Developmental Conditions, J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 2003, vol. 294, pp. 1–13. 
[28] 
S.G. Krylova, E.P. Zueva, T.G Razina, et al., “Effect of Apothrombostatin and Thiacarpin on the Efficiency of Cytostatic Therapy in Rats with Transplantable Tumor”, Vestn. Dal. Vost. Otd. RAN, 2007, no. 6, pp. 111–115. 
[29] 
T.E. Warkentin, “Bivalent Direct Thrombin Inhibitors: Hirudin and Bivalirudin”, Best Pract. Res. Clin. Haematol., 2004, vol. 17, pp. 105–125. 
[30] 
S. Koyanagi, N. Tanigawa, H. Nakagawa, et al., “Oversulfation of Fucoidan Enhances Its Antiangiogenic and Antitumor Activities”, Biochem. Pharmacol., 2003, vol. 65, pp. 173–179. 
[31] 
W. Halfter, S. Dong, B. Schurer, and G.J. Cole, “Collagen XVIII is a Basement Membrane Heparan Sulfate Proteoglycan”, J. Biol. Chem., 1998, vol. 273, pp. 25404–25412. 
[32] 
M.S. Pereira, B. Mulloy, and P.A. Mourao, “Structure and Anticoagulant Activity of Sulfated Fucans. Comparison Between the Regular, Repetitive, and Linear Fucans from Echinoderms with the More Heterogeneous and Branched Polymers from Brown Algae”, J. Biol. Chem., 1999, vol. 274, pp. 7656–7667. 
[33] 
D.N. Menton, and A.Z. Eisen, “Cutaneous Wound Healing in the Sea Cucumber, Thyone briareus”, J. Morphol., 1973, vol. 141, pp. 185–203 
[34] 
B.D. Fredalina, B.H. Ridzwan, A.A. Abidin Zainal, et al., “Fatty Acid Compositions in Local Sea Cucumber, Stichopus chloronotus for Wound Healing”, Gen. Pharmacol., 1999, vol. 33, pp. 337–340.